发布时间:2016-06-27 10:15:13
柬埔寨皇家生殖遗传医院(RFG)
赵皖秋, 任文娟, 李伟, 刘珊· (陕西省妇幼保健院生殖中心.西安 710003) 【摘要】 目的 检测父/母为乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染者的胚胎中是否存在 HBV DNA,探讨 HBV经配子垂直传播的可能性,同时评估影响垂直传播发生的相关因素。 方法 收集单方 HBV感染的229对夫妻的3lo个废弃胚胎。采用套式聚合酶能反应(PCR)法测定胚胎样本中的 HBV DMA。采用 Logistic回归分析患者年龄、血清 HBV DNA载量、血清HBV多种抗原或抗体存在情况及授精方法等因素与 HBV DMA存在的相关性。 结果 7 74%(24/3lo)的胚胎中检出了HBV DNA;血清 HBV DNA载量与胚胎中存在 HBVDMA呈显著正相关[CIR4 l28,95% Cf(l. 3l9,l2 9l4),P=0 0l5];授精方式(IVF或 ICSI)的差异对胚胎 HBV DNA阳性检査率几乎无影响(P>0 o5);同一对夫妻的多个胚胎中只有部分胚胎存在 HBV DNA。 结论 垂直传播可能是 HBV重要的传播途径之一。对子 HBV DNA高载量的父/母,自然受孕或助孕治疗前建议进行针对性治疗,以降低胚胎感染 HBV的风险 。 【关键词】 乙型肝炎病毒; 胚胎; 垂直传播; HBV载量 乙型肝炎病毒( HBV)感染可导致急\\慢性肝炎、肝硬化以及肝细胞癌, 全球约20亿人感染HBV,其中超过3. 50亿人为慢性感染,国内做为 HBV感染高发地区,约60%的国内人有 HBV 感染史, 9. 8%的国内人为 HBV慢性感染者。 HBV感染高发的一个重要原因是 HBV可以垂直传播,估计超过30%的 HBV感染是通过母婴垂直传播获得。母婴垂直传播可分为产前传播、产时传播及产后传播, 产前传播也称宫内传播,通常认为 HBV突破胎盘屏障是造成胎儿宫内感染的最主要原因;产时传播主要是指胎儿在分娩过程中,由于宫缩而吞咽含有 HBV的母体血液、羊水以及阴道分泌物等母体体液,或因为胎意血管破裂,母血渗入胎儿血液中造成母婴垂直传播;产后传播即通过接触父母唾液、母乳喂养以及其他生活上的密切接触而造成的 HBV感染。 传统观念认为,乙肝的垂直传播就是母婴垂直传播,但自 Hadchoue1等研究发现 HBV DNA可整合到精子基因组中后,越来越多的研究提示 HBV可能经过精子垂直传播。近期的研究则发现 HBV DNA可整合入仓鼠卵细胞基因组中, HBV感染者不同发育阶段的卵细胞均可检出乙肝核心抗原(HBcAg)和 HBV DNA,提示 HBV感染可能经过生殖细胞(精子和卵细胞)发生垂直传播。 目前,虽然有间接证据提示 HBV可能通过感染生殖细胞进行垂直传播,但尚缺乏足够的直接证据支持, 本研究通过检测父/母为 HBV慢性感染者的废弃胚胎中是否存在 HBV DNA,为 HBV是否可通过生殖细胞传播提供直接证据,同时评估影响该垂直传播发生的相关因素。 材料与方法 一、主要设备与试剂 Applied Biosystems Veriti96 We11 Therma1 Cycler PCR仪购自美国 Life Techno1ogies公司; Bio-RAD PowerPac电泳仪购自美国伯乐公司;JS680CR全自动凝胶成像分析仪购自上海培清科技有限公司;HBV DNA Detection试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。 二、研究方法 1.样本收集及处理:实验样本来源于2012年9月至2014年3月在我院辅助生殖中心行辅助生殖助孕治疗、单方 HBV感染的229对不育夫妇的废弃胚胎(共310个), 本研究将乙肝表面抗原( HBsAg)阳性持续半年以上者认定为 HBV感染, 从单纯男方 HBV感染的140对夫妇中获得废弃胚胎181个,从单纯女方 HBV感染的89对夫妇中获得废弃胚胎129个,本研究经我院伦理委员会审议通过,并患者知情同意. 上述单方 HBV感染者均进行了乙肝七项检测:乙肝表面抗体(HBsAb)、乙肝 e抗原(HBeAg)、乙肝 e抗体(HBeAb)、乙肝核心抗体(HBcAb)、乙肝核心 IgM型抗体(HBcAb-IgM)和乙肝 S1抗原(HBSIAg)及血清 HBV DNA载量测定。 另外,选取同期在我院接受辅助生殖助孕治疗、未感染 HBV的不育夫妇的废弃胚胎80例做为阴性对照。 本研究所纳入胚胎均为人工授精后培养 72 h的废弃胚胎(异常受精或低于移植标准的胚胎), 经PBS清洗3次后,用毛细吸管将胚胎移入聚合酶链反应(PCR)管底,液氮冻存备用。 三、HBV DNA检测 使用 HBV DNA Detection试剂盒检测胚胎中是否存在 HBV DNA。采用套式 PCR法特异性扩增乙肝病毒 DNA中的 S基因(基因序列第506~ 645) ,S基因编码合成乙肝表面抗原的主蛋白,其与前 S抗原共同组成乙肝表面抗原。因商品试剂盒PCR引物序列保密,故本文不能提供引物序列信息。首次 PCR扩增的产物大小约510 bp,二次PCR扩增的产物大小约230 bp。以试剂盒提供的阳性模版做为阳性对照,其首次 PCR扩增产物大小约603 bp,次 PCR扩增产物大小约350 bp。 套式 PCR操作如下:向含有胚胎样本的 PCR 管中直接加入 PCR反应液25 µ1,振荡、离心后,按以下条件进行第1次扩增:94℃预变性1 min,94℃变性30 s,55℃复性30 s,72℃延伸30 s,共30个循环;再取2 µ1第1次扩增产物做为模版,加入23 µ1 PCR反应液,按以下条件进行第2次扩增: 94℃变性30 s,55℃复性30 s,72℃延伸30 s,共35个循环, 扩增产物进行 2%的琼脂糖凝胶电泳,显示特异性扩增条带者视为 HBV D1、1A阳性。 HBV DNA载量的测定,则按照临床常规,由我院临床检验科统一测定。 四、统计学分析 采用 SPSS13. 0软件进行数据统计分析,分类变量比较来用卡方检验,相关性分析来用 Logistic 回归分析, P<0 05为差异具有统计学意义。 结 果 一、PCR检测结果 单纯男方 HBV感染的140对夫妻中13例(9.3%)检测到 HBV DNA阳性胚胎,单纯女方HBV感染的89对夫妻中11例(12. 4%)检测到阳性结果(表1)。 在所检测的310例胚胎样本,检出 HBV DNA 阳性胚胎样本24个,检出率为7. 74%。其中男方HBV感染者来源的181例胚胎中检出13例阳性, 检出率为7. 18%;女方 HBV感染者来源的129例胚胎中检出11例,检出率为8.53%。经卡方检验,两者检出率无显著性差异(P>0.05)。 80例阴性对照胚胎未有阳性结果检出。 二、胚胎 HBV感染相关性因素分析 胚胎 HBV感染相关性因素分析来用 Logistic 回归分析,入选因素包括:男/女方年龄、 HBsAb、HBeAg、 HBeAb、 HBcAb、 HBcAb-IgM、 HBSIAg、血清 HBV D1、1A载量和授精方式[体外受精( IVF) 或卵胞浆内单精子注射(ICSI)]。 Logistic回归初始模型分析发现 HBeAg阳性、HBeAb阳性和 HBV DNA高载量(HBV DNA拷贝数>106/m1)与胚胎 HBV感染具有显著相关性(P<0 .05)。排除混杂因素后,Logistic回归分析发现仅 HBV DNA高载量与胚胎 HBV感染呈显著正相关[0R4 128,95% CI(1. 319,12. 914),P= 0 .015](表2)。此外,单独对单纯男/女方为 HBV 感染者的样本来用卡方检验和 Logistic回归分析发现:授精方式(IVF或 ICSI)的差异对胚胎感染HBV的几率无显著影响(P>0 05)(表1)。 研究结果还发现:4对单纯男性 HBV感染和5 对单纯女性 HBV感染夫妻同一批次多个胚胎中, 仅有1个胚胎检出 HBV DNA,并非所有受检胚胎 HBV DNA均为阳性(表3),提示源于同一对夫妻的多个胚胎中只有部分胚胎感染HBV。
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