发布时间：2016-06-27 10:08:51
柬埔寨皇家生殖遗传医院（RFG）
柳榴,刘倩,文妍琪,杨書·
(武汉大学人民医院生殖医学中心,武汉430060) 【摘要】 目的 评价乙型肝炎病毒(HBV)感染及 HBV-DNA高拷贝数的不孕妇女的卵巢储备功能。 方法 回顾性分析来院进行体外受精/卵胞浆内单精子注射一胚胎移植(IVF/ICSI-ET)治疗的505例不孕患者,根据血清 HBsAg是否阳性及 HBV-DNA摘度将实验对象分为3组:血清 HBsAg(-)为 A组;血清 HBsAg（十),HBV-DNA<500 IU/m1为 B组; HBsAg(十),HBV-DNA≥500 IU/m1为 C组 。评估3组患者的基本情况,并以血清基础 FSH、LH、E2水平和 AFC等为指标,分析比较 HBV感染状态与卵巢储备功能的关系。 结果 (l)HBV-DNA阳性率(摘度≥5oo IU/m1)在 HBV感染的不孕妇女中为48. 60%,平均 HBV-DNA拷贝数为5. 86XIO\' IU/m1(5Xl02-l. 28Xl0° IU/m1);(2)与 A组相比,C组患者中 AFC<6的发生率更高(9. 62% vs 2. o6%),差异有统计学意义(P<0 o5);且 C组患者在卵巢储备功能低下(AFC< 6)的不孕妇女群体中所占的比例显著高子在卵巢储备功能正常(AFC≥6)的不孕妇女群体中所占的比例(45. 4% vsl9. 5 % ,P<o. o5 ) ,而 A组患者在卵巢储备功能低下的不孕妇女群体中所占的比例明显低子在卵巢储备功能正常的不孕妇女群体中所占的比例(27. 3% vs. 59. 0%,P<0. 05),B组则在两个群体所占的比例无显著差异(27. 3% vs. 2l. 5%,P> 0. 05);(3)多元逻辑回归分析显示,与 A组相比,C组卵巢储各功能低下的风险更高[CIR3. 689,95% Cf(l. 043,l3. 048)] (P<o. o5)。 结论 在 HBV感染的妇女中,HllV-「)NA高持贝数可能是卵巢储备功能低下的高危因素,其可能会影响不孕女性的卵巢储备功能。 【关键词】 HBV; HBV-DNA; 不孕; 卵巢储备功能 卵巢储备功能是指卵巢皮质区卵泡生长发育形成可受精卵细胞的能力,通常包括两方面:卵巢内存留卵泡数和卵细胞的质量,它能够综合的反映女性的生育能力。评估女性卵巢储备功能通常所用的指标有:年龄、基础血清卵泡刺激素(FSH)水平、基础血清1ll住激素(E)水平、基础 FSH/黄体生成激素(LH)比值FSH/LH)、卵巢体积、基础窦卵泡数(AFC)及卵巢基质收缩期血流、抗苗勒管激素(AMH)等。一般认为,当 FSH>10 U/L、E2>294 pmo1/L、FSH/LH>3、 AFC<6时均意味着卵巢储备功能低下。且目前认为,基础窦卵泡与基础性激素、各种刺激试验相比更能有效评估卵巢储备功能。 HBV作为一种噬肝性病毒,除了存在于肝细胞,还存在于生殖性腺,如卵巢间质细胞、卵细胞、睾丸等肝外组织,并可通过生殖细胞垂直传播。近年来,在接受辅助生殖技术( ART)治疗的夫妻中发现 HBV感染的患者越来越多。已有研究报道HBV能够感染精子,进而影响精子的质量和功能。然而对于HBV是否能够影响卵巢的储备功能，目前的研究尚无明确结论。针对这一问题，本研究对进行不孕治疗的女性HBV阳性患者与隐形患者比较，旨在探讨女性HBV感染状态与卵巢储备功能的关系。 资料与方法 一、研究对象 回顾性分析2012年4月至2014年12月在武汉大学人民医院生殖中心进行IVF/ICSI-ET治疗的不孕妇女。 纳入/排除标准：年龄≤38岁，无子宫内膜异位症史和卵巢手术史，且排除HCV、HIV和梅毒阳性者。 二、病毒检测及卵巢储备功能参数检测回顾 患者在进行 IVF/ICSI-ET治疗前,均常规筛査术前病毒全套. 对于血清 HBsAg阳性的患者再常规进行 HBV-DNA检测,HBV-DNA滴度≥500 IU/m1 为阳性;有效期为12个月.进入治疗周期后,常规于月经第2天或第3天采血做性激素全套检测,并测量 AFC。 检测方法:来用电化学发光法检测乙肝表面免疫标志物,仪器为 ROCHE全自动化学发光免疫分析仪(型号 Cobas e601),试剂为 ROCHE仪器配套试剂盒;来用荧光定量 PCR(fluorescence quantita- tive PCR,FQ-PCR)法检测血清 HBV-DNA,仪器为 ROCHE实时荧光定量 PCR仪(型号 LC480) , PCR试剂盒购自上海复兴生物技术有限公司,所有操作严格按照试剂盒说明书进行。 三、分组及资料收集 根据血清 HBV检査结果分组: ( 1) HBV( - )组:血清 HBsAg阴性(A组,n=291) ;(2)HBV(十) HBV-DNA(- )组:血清 HBsAg阳性, HBV-DNA <500 IU/m1(B组,n= 110); (3) HBV(十) HBV- DNA(十)组:血清 HBsAg阳性, HBV-DNA≥500 IU/m1(C组,n= 104) 。 收集的基本资料包括:年龄、体重指数(BMI)、不孕时间、不孕类型(原发/继发)、病毒筛査结果、基础血清 FSH、LH和 E2水平及 B超下 AFC值。 四、统计学分析 数据采用 SPSS2L 0统计软件进行分析。计量资料用均数土标准差(
土s)表示,计数资料用率(%)表示;对资料进行方差分析、t检验、卡方检验; 在调整了年龄、BMI、不孕时间、不孕类型等因素后, 使用多元逻辑回归分析对 HBV感染状态与卵巢储备功能低下的关系进行了评估, P<0 05为差异有统计学意义。
结 果
一、一般资料
本研究共纳入了来我院进行不孕治疗的女性患者505例,其中血清 HBV阳性患者214例,血清HBV阴性患者291例。
在214例 HBV感染者中血清 HBV-DNA滴度阳性者104例,阳性率为48.60%,DNA拷贝数为5X10²~1.28X10（九次方）IU/m1,平均为5.86X10（4次方）IU/m1。
二、各组间临床基础数据的比较
我们对3组患者的年龄、BMI、不孕时间、不孕类型等进行了比较,同时也比较了3组之间月经第2或第3天血清基础FSH、LH、E2水平及基础 AFC 等指标, 结果显示3组间的临床基础数据均无统计学差异(P>0. 05)(表1)。
三、 HBV感染与卵巢储备功能下降之间的关系
1. 不同HBV感染状况下卵巢储备功能低下的发生率:卵巢储备功能低下的判断标准为 AFC<6和/ 或 FSH>10 U/L、FSH/LH>3、E2>294 pmo1/L。研究发现,C组中 AFC<6的发生率显著高于A组(P<0 05),且有高于 B组的趋势但无统计学差异(P>0 05);而3组间基础血 FSH>10 U/L、FSH/ LH>3、E2 >294 pmo1/L的发生率均无统计学差异(P>0 05)(表2)。
2.卵巢储备功能与各观察指标及 HBV感染状况的关系:我们基于 AFC水平(<6或 ≥6 )分析了各项指标与卵巢储备功能低下之间的关系, 发现 AFC<6的患者年龄显著增高(P<0.05) , 而其他各项指标无统计学差异(P>0. 05) (表3)。
（插图表1、2、3）
同时,我们也分析了 HBV感染状态与卵巢储备功能低下之间的关系,发现 C组的患者在卵巢储备功能低下之间的关系，发现C组患者在卵巢功能低下(AFC<6)的患者中所占的比例大于在卵巢储备功能正常(AFC≥6 )的患者中的比例(P<0. 05);相反,A组的患者在卵巢功能下降(AFC<6)的患者中的比例小于在卵巢功能正常(AFC≥6)患者中的比例(P<0. 05) ;而 B组患者与卵巢储备功能低下无关(P= 0. 52)(表4)。
四、逻辑回归分析
以卵巢储备低下作为应变量,年龄、 BMI、不孕时间、不孕类型、 HBV感染状态作为因变量,我们对卵巢储备功能低下与 HBV感染状态之间的关系进行了多元逻辑回归分析, 在调整了年龄、BMI、不孕时间、不孕类型后,与 A组相比,C组的卵巢储备功能低下的发生凤险显著增大[0R 3.689,95% CI(1.043,13.048)](P<0 05),但是 B组卵巢储备功能低下的发生风险与A组相比无统计学差异[0R3.598,95% CI（0.912,14.196);P>0 05](表5)。
讨 论
我国是 HBV感染的高发流行区,人群中HBsAg阳性率为7 2% ,其中处在婚育年龄人群的HBV携带率近10%。而近年来,在来医院进行IVF/ICSI-ET治疗的不孕女性患者中,血清乙肝表面抗原(HBsAg)阳性或 HBV-DNA拷贝阳性的患者比较常见。在 HBV感染的患者中,血清中 HBV- DNA含量是反映病毒活跃程度最直接、最可靠的指标。本研究主要是分析 HBV感染状态与卵巢储备功能的关系。
本研究搜集到感染 HBV的不孕患者214例, HBV-DNA阳性率为48.60%。研究发现,在 HBV感染的不孕妇女中,HBV(十) HBV-DNA(十)是卵巢储备功能低下(AFC<6 )的高危因素,使卵巢储备功能低下的发生风险增大。 窦卵泡是指阴道超声下卵巢内可见的直径2-9mm的卵泡,是成熟卵泡的前体,AFC能够很好地反应卵泡池中剩余的原始卵泡数,是卵巢储备功能的直接体现。目前认为,基础窦卵泡与基础性激素、各种刺激试验相比更能有效评估卵巢储备功能。Hu等对HBsAg 阳性而其配偶阴性的女性进行 HBV-DNA和 RNA 的分析,发现 HBsAg存在于卵细胞的细胞核、细胞质和胚胎。而在卵细胞或胚胎中的 HBV-DNA能够复制,并且在 mRNA和蛋白质水平上表达。有研究表明在通过血睾屏障进入睾丸的HBV-DNA在复制的同时还会有一定数量整合到精子染色体,影响精子遗传物质的稳定性进而影响精子的质量,同时, HBV-DNA表达的部分成分能够导致精子线粒体膜电位的缺失,最终降低精子的活力;另外, HBV感染另一潜在的病理致病机制为:在感染的局部组织通过抗原-抗体复合物的沉积引起局部的免疫反应或炎性反应,导致相关功能的破坏。而这些致病机理可能同样适用于整合入卵巢组织和卵细胞的 HBV-DNA, 2013年李苗发现 HBV感染可以促进卵巢颗粒细胞的凋亡,因此 HBV-DNA的感染可能会损伤卵巢组织和细胞,引起卵细胞储备功能如 AFC的改变,而有研究表明 AFC<6与卵巢低反应和低妊娠率相关。因此,当血中 HBV-DNA大量存在时,能够对卵巢储备功能造成一定的影响。
同时，本研究显示除AFC＜6的发生率在HBV（+）HBV-DNA(+)组比HBV（-）组更高外，其余FSH>10 U/L、FSH/LH>3、E,>29,1 pmo1/L的发生率在三组间的差异均不具有统计学意义。推测可能的原因:垂体分泌的 FSH、LH是受下丘脑促性腺激素释放激素 GnRH 及卵巢雌激素的共同协调作用来调控的,卵巢储备功能若受到影响,卵泡数目减少,从而其分泌的雌孕激素会减少,造成对垂体FSH、LH的遏制作用减弱,从而导致血清 FSH、LH升高,但是它们的变化比 AFC的变化发生的较晚。同时卵巢或卵细胞中虽然存在 HBV-DNA,其含量远远低于血清,卵巢组织或卵细胞可能会通过某种机制逃避一些 HBV-DNA造成的部分免疫伤害。其次,即使存在 HBV-DNA整合到染色体,造成遗传物质稳定性的改变,或者在HBV感染局部存在免疫、炎症反应,但是卵巢或卵细胞同时也存在一定程度的自我修复功能,能修复部分所造成的损伤。因此 HBV感染患者中高HBV-DNA滴度对卵巢储备功能或 AFC的影响可能还不足以引起 FSH、LH、E2等一些指标的明显的改变。
本文的不足之处在于临床样本量有限,因此该结论仍然需要更大样本量的研究来证实。同时，由于临床样本量鞥原因，本文并没有加入AMH指标，而相比于其他指标，AMH能更早的、准确的评估卵巢储备功能，其灵敏度和特异性与AFC相当。因此，期待着后者能有相关研究针对AMH这一指标来进行进一步的论证。
总之，本研究的初步结果显示，在HBV感染的不孕妇女中，HBV-DNA的高滴度存在是卵巢储备功能低下的高危因素，能促进卵巢储备功能低下的发生。同时由于本研究样本量有限，仍然需要大样本的研究来证实，且其具体的潜在机制有待于进一步的研究。
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