体外受精中1PN及 0PN(2PB)胚胎发育替能及影响因素分析

体外受精中1PN及 0PN(2PB)胚胎发育替能及影响因素分析

张亚摘,  殷宝莉,  张翠蓮·,  韦多,  郝好英,  宋小兵,  谢娟珂

(郑州大学人民医院生殖医学研究所/河南省人民医院生殖医学研究所,郑州  450003)

【摘要】   目的   初步探讨体外受精一胚胎移植周期中lPN及 OPN(2PB)胚胎形成的影响因素和发育潜能,以探寻提高**利用率的可行性方法,    

方法   对787个 IVF周期和298个 ICSI周期患者授精后l8-20 h观察到的lPN及 0PN (2PB)胚胎继续进行体外培养,观察其原核及卵裂情况,序贯培养至 D6 ,观察囊胚形成情况;并回顾性分析这些患者的临床资料,研究lPN及 OPN(2PB)胚胎形成的影响因素。    

结果   (l)lPN及 OPN(2PB)胚胎可卵裂并形成囊胚,但卵裂率(分别为90.l6%和88.ll%)和囊胚形成率(l7.09%和30.03%)均显著低子2PN胚胎(分别为98.40%和45.7l%)(P均<0. 05);             (2) lPN胚胎的形成随患者的年龄、体外受精方式及获卵数的不同而不同,而 0PN(2PB)胚胎的形成只随患者年龄不同而异(P< 0.05);

        (3)经 Logistic回归分析发现,lPN和 0PN(2PB)胚胎的形成与患者选择的受精方式、MII卵数、2PN胚胎数相关(P< 0.05),而与患者的年龄、体重指数、基础内分泌水平及获卵数无关(P< 0.05)。

结论   患者的体外受精方式、获得的 MII卵数以及受精后的2PN胚胎数可能影响到1PN和0PN(2PB)胚胎的形成;lPN及0PN(2PB)胚胎有一定发育潜能,但较2PN胚胎低;在行補助生殖技术助孕过程中,应综合考虑各种影响因素,以降低lPN和 0PN(2PB)胚胎的发生率,提高**的临床利用率。

【关键词】   体外受精;   单原核(1PN)胚胎;  胚囊;   发育潜能;   Logistic回归

     在人类体外受精一胚胎移植(IVF-ET)技术中, 常于授精后 16~20 h 内通过光学显微镜对胚胎原核数目进行观察及评分,正常受精的判断标准为观察到胚胎内存在明确的2PN(pronucleus)及2PB (polar body)。然而,在胚胎培养过程中,常有相对较多的异常受精情况出现,其中 IPN的发生率约为2%~5%。在临床治疗过程中, 1PN及 0PN (2PB)胚胎通常被视为异常受精胚胎,与多原核胚胎及发育停滞的 2PN胚胎一起作为废弃胚胎被销毁。事实上,部分1PN及 0PN(2PB)胚胎是正常受精的胚胎,只是因为错过了最住的观察时机,被误认为是异常受精,如果将这类胚胎全部销毁,会造成胚胎资源的浪费。

    本研究回顾性分析787个IVF周期和298个ICSI周期患者的1PN 及 0PN(2PB)胚胎的继续培养情况,探讨这类“异常受精”胚胎的发育潜能,同时分析患者的l1告床资料,研究1PN 及 0PN(2PB)胚胎形成的影响因素,为降低1PN 及 0PN(2PB)胚胎的发生率,提高**利用率提供指导。

                                       资料与方法

 一、临床资料       选择2014年7月28日至2014年10月31日就诊于河南省人民医院生殖中心的不孕症夫妇的临床资料。

    纳入标准:基础内分泌水平正常;≤3个治疗周期;HBV及 HIV阴性。

    排除标准:生殖泌尿系统急性感染或性传播疾病;严重的遗传、躯体疾病或精神疾患;**等不良嗜好;获卵数< 1个;短时受精联合早期补救 ICSI(Re-ICSI)。

        本研究共包括787个 IVF周期和298个 ICSI周期的不孕症夫妇的临床资料。

二、患者诊疗方法回顾

   1. 促排卵方案及**的采集与处理:接受IVF-ET治疗的不孕症患者采用本中心常规方案进行控制性促排卵,当 ≥ 3个卵泡直径达18 mm时,结合血清雌二醇(E2 )、孕酮(P)值,适时予以HCG(丽珠制药)5000~10 000 U肌肉注射;36 h后在阴道超声引导下,使用18 G取卵针(Cook,瑞典)来集卵冠丘复合体( OCCC),将其于加有G-MOPS缓冲液( Vitrolife,瑞典)的培养皿中洗涤两次后,转入含G-IVF-PLUS培养液(Vitrolife,瑞典)的培养皿中,置于37℃、体积分数6% C02、体积分数5% 02的饱和湿度培养箱中培养。

    2. 精子处理: 精液处理来用密度梯度离心法。处理后的精子沉淀经1 m1的G-IVF-PLUS培养液Vitrolife,瑞典)上游后,取上游液分析精子浓度。

    3.受精:IVF周期患者于取卵后约3 h后行体外授精,加精浓度为每卵 0 5~1万条精子;精卵共孵育约,1 h后机械剥离颗粒细胞,转入含有G,-PLUS培养液(Vitrolife,瑞典)的培养皿中。

    ICSI周期患者于取卵后约3 h后将孵育后的**经透明质酸酶(Vitrolife,瑞典)消化后机械剥离颗粒细胞,将**置于含有G-IVF-PLUS 培养液(Vitrolife,瑞典)的培养皿中预培养1 h后, 挑选形态相对正常的精子对成熟的**行单精子注射,注射后的**转入含 G1-PLUS培养液(Vitrolife,瑞典)的培养皿中培养。

    4.胚胎观察及评分:授精后18~20 h于倒置显微镜下观察受精情况,记录原核数目, 原核和胚胎形态学的观察参照之前的研究。若观察时胚胎出现两个原核及两个极体,则为2PN胚胎;若只有一个原核,则为1PN 胚胎;若观察不到原核但有两个极体,则为 0PN( 2PB)胚胎。

    2PN胚胎于 D2和 D3在倒置显微镜下评估卵裂期胚胎的形态,包括胚胎细胞数、碎片比例、细胞大小是否均匀等情况,参照文献标准。可利用胚胎为细胞数多于4个且评分高于2分的胚胎,可继续培养至囊胚;根据患者的具体情况决定其2PN胚胎的去向:移植、冷冻或是囊胚培养。进行囊胚培养的2PN胚胎,于 D5和 D6对囊胚进行评估,囊胚分级的方法为 Gardner囊胚分级法。我中心可利用囊胚标准为:3BB及以上的囊胚;优质囊胚标准为:评分为4AA、4AB、4BA和 IBB的囊胚;可利用囊胚及优质囊胚可进行移植或冷冻保存,冷冻的囊胚择期复融后进行移植。

    临床上常规将1PN胚胎及 0PN( 2PB)胚胎丢弃。本研究中所有的1PN及 0PN(2PB)胚胎均进行序贯培养,培养至 D6 ,胚胎及囊胚的评分标准同上。

    上述整个过程均取得患者的知情同意且获得医院伦理委员会的批准。

三、观察指标

    2PN胚胎形成率= (2PN胚胎数/获卵数)X 100%;2PN胚胎卵裂率= (发生卵裂的2PN 胚胎数/2PN胚胎数) x100% ; 2PN 囊胚形成率= (2PN胚胎形成的囊胚数/进行囊胚培养的2PN胚胎数)X 100%。

    相应的1PN 及 0PN(2PB)胚胎的形成率、卵裂率、囊胚形成率来用类似计算方式。

四、统计学处理

    所有数据来用 SPSS17.0软件进行统计学处理, 数据结果以均数土标准差(？土s)或率(%)表示,组间两两比较采用 LSD-t检验,率的比较来用x2检验;P<0.05为差异有统计学意义。

                                          结      果

一、患者基本情况分析       787例行 IVF治疗的患者,年龄为(31.94土5 63)岁,患者的体重指数(BMI)为(23. 26土3. 65)kg/m2;298例行 ICSI治疗的患者,年龄为(32.11土6.86)岁,患者的 BMI为(23.02土7.52)kg/m2。两组患者的基本资料和基础内分泌水平均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

    IVF治疗周期共415个周期进行了移植,共移植了760个2PN胚胎,临床妊娠241例;ICSI治疗周期有164个周期移植了264个2PN胚胎,临床妊娠102例。

二、1PN及0PN(2PB)胚胎形成及继续囊胚培养结局

    370个 IVF周期的患者出现了1PN和 0PN(2PB)胚胎,形成1PN胚胎305枚,卵裂275枚,形成囊胚47枚; 0PN(2PB)胚胎412枚,卵裂363枚, 形成囊胚109枚,了1PN和 0PN(2PB)胚胎的卵裂率及囊胚形成率均显著低于2PN胚胎(P<0.05) (表2)。

      61个 ICSI周期的患者形成了1PN和0PN (2PB)胚胎,其中1PN胚胎71枚,卵裂66枚,形成囊胚5枚;2PB胚胎25枚,卵裂21枚,形成囊胚3枚.

三、女方年龄与1PN及0PN(2PB)胚胎形成的关系

    女方年龄范围为20~49岁,中位数为31岁,以30岁、35岁为界值对患者进行分组。与>35岁组患者比较, 30~ 35岁组患者的2PN胚胎卵裂率、0PN(2PB)胚胎形成率及其卵裂率较高,且差异有统计学意义(P<0.05),而<30岁组患者的0PN (2PB)胚胎卵裂率较高,差异有统计学意义(P< 0.05)(表3)。

四、体外受精方式与1PN及 OPN(2PB)胚胎形成的关系

    体外受精一胚胎移植周期中,常规 IVF周期的平均获卵数、1PN及 0PN(2PB)胚胎的发生率均高于 ICSI周期(P<0.05) ;而两组之间的1PN及 0PN (2PB)胚胎的卵裂率及囊胚形成率并无显著性差异(P>0.05)(表4)。

五、获卵数与1P1、1 及 0P1、1(2PB)胚胎形成的关系

    获卵数的中位数为9枚(1~48枚),以5、10、15、20为界值,对患者进行分组。各组的1PN胚胎形成率及卵裂率以及 0PN (2PB)胚胎的形成率均无统计学差异(P>0.05),但各组之间2PN胚胎的形成率及卵裂率、0PN(2PB)卵裂率及2PN优质胚胎率存在显著性差异(P<0.05)(表5)。

六、Logstic回归分析结果

    以是否有1PN胚胎形成为因变量,纳入患者年龄、体重指数、基础内分泌(FSH、 LH、 E2、PRL、P、T)水平、受精方式、获卵数、MII数、正常受精数为自变量,进行 Logistic回归分析,以α= 0. 05为检验水准,P<0. 05认为差异有统计学意义。

    分析发现，1PN胚胎的形成与患者选择的受精方式、MII卵数、2PN数显著相关(P<0.05) , 而与患者的年龄、体重指数、基础内分泌(FSH、LH、 E2、 PRL、 P、 T)水平、获卵数等无关(P> 0.05),  与 IVF周期相比,ICSI周期中更可能出现1PN胚胎(P<0. 05) ;当患者的 MII卵数越多,2PN胚胎数越少时,越易形成1PN胚胎(P< 0.05)。

    同样,以是否有0PN(2PB)胚胎形成为因变量,进行 Logistic回归分析,发现 0PN(2PB)胚胎的形成与患者选择的受精方式、MII卵数、2PN数有关(P<0. 05) ,而与患者的年龄、体重指数、基础内分泌(FSH、LH、E2、PRL、P、T)水平、获卵数等无关(P>0. 05)。 与 ICSI周期相比,IVF周期中更可能出现 0PN(2PB)胚胎(P<0. 05) ;当患者的 MII卵数越多, 2PN胚胎数越少时,越易形成 OPN(2PB)胚胎(P<0. 05)。

                                     讨      论

     目前国内外学者认为1PN胚胎可能的发生机制主要有以下方面:

①孤雌激活;

②精子染色体解聚异常;

③雌原核形成异常;

④雌雄原核融合;

⑤雌雄原核形成不同步;

⑥成熟前原核核膜崩解(premature   pronuclear   enve1ope   breakdown, pPNBD) ：最近一项新的研究发现,对1PN胚胎行 FISH检测   

    发现其有两个原核,这是以上的机制难以解释的,进一步采用免疫细胞化学检测,证实了pPNBD的发生可能是导致1PN胚胎形成的另一机制。另外,约30%~40%的卵受精18~20 h后在倒置显微镜下观察不到原核,只看到两个第二极体即0PN(2PB)胚胎,继续观察发现,部分0PN(2PB)胚胎仍可发生卵裂或是形成胚胎,其外观形态和卵裂率与正常受精的胚胎相似,因此未观察到原核并不意味着未发生受精。

    导致 0PN(2PB)形成的原因主要有以下几个方面:

①雌雄原核发育不同步;

②受精缺陷;

③第二极体参与到核遗传物质的形成过程。从上述机制可以发现,部分1PN及0PN (2PB)胚胎是正常受精的胚胎,只是因为错过了较好的观察时机而导致只观察到1个原核或是没有原核,尽管如此,仍有一部分是异常受精的胚胎。

    临床上经常会遇到一些患者,获卵数较少,经过体外受精后往往无2PN胚月合,而形成了1PN或 0PN(2PB)胚胎, 对于此类患者,可进行多次原核观察,以期发现第二个原核。但反复多次地将培养皿取出进行观察会带来胚胎生长环境的不断变化,可能会对胚胎的正常发育造成一定的不良影响;此外,多次观察会大大地增加胚胎实验室工作人员的工作量, 而近些年来兴起的 time-1apse技术虽然可以在封闭环境下动态地观察胚胎发育情况,但因其价格昂贵且不能有效地改善妊娠结局及辅助生殖技术的安全性, 尚未在各个生殖中心广泛采用, 所以本研究将探讨这类胚胎的发育潜能及可能的影响因素。

    在本研究中, IPN胚胎的发生率为3. 65% (IVF周期)、3. 01%(ICSI周期) ,与先前报道的2% ~5%相似。与正常的2PN胚胎相比,1PN胚胎的形成在患者基本情况、促排卵方案、胚胎发育情况等方面均无统计学差异。目前有多个研究对获卵数与 ART妊娠结局之间的关系进行研究,但研究结果并不一致。有研究证明,1PN胚胎的周期中卵冠丘复合体的数目较多[\'6], 我们根据获卵数的多少对患者进行分组,各组的1PN胚胎形成率及卵裂率以及0PN(2PB)胚胎的形成率均无显著差异,但2PN的形成率及卵裂率、0PN(2PB)胚胎卵裂率及2PN优质胚胎率则存在显著差异, 本研究还发现1PN胚胎的形成可能与 MII**数及本周期中形成的2PN胚胎数相关,当患者本周期的 MII **数较多而2PN胚胎数目较少时,往往更可能会出现1PN胚胎,因为就每个周期的 MII**而言,授精后会形成 0PN(2PB)胚胎、1PN胚胎、2PN 胚胎、多 PN胚胎,以及1PB胚胎,当 MII **数目较多,而其余各种类型的胚胎尤其是2PN 胚胎较少时,则较易出现1PN胚胎,,母方年龄在体外受精一胚胎移植周期中起着关键性的作用. 本研究发现,随着女方年龄的不断增长,IVF及 ICSI授精方式下1PN胚胎的发生率与卵裂率无统计学差异,而30~35岁的患者 0PN (2PB)的发生率较其他年龄组高, 为了进一步探讨授精方式对1PN胚胎形成的影响,对患者进行分组研究结果显示,IVF授精方式下1PN及 OPN(2PB) 胚胎的发生率均高于 ICSI组(P<0.05) ,而两组的卵裂率及囊胚形成率并无显著性差异, 这说明两种授精方式下 IPN来源胚胎的发育潜能无统计学差异,有研究表明,对 IVF和 ICSI周期中1PN胚胎进行荧光原位杂交(FISH)后发现, IVF周期中由1PN胚胎发育来的胚胎,其胚胎性染色体二倍体率为54. 35%,单倍体率为23.91%,嵌合体率为21.74%;而在 ICSI周期中,分别为34.62%、34. 62%和30 77%,这表明 IVF周期的单原核孕卵有一定的移植价值,而 ICSI中1PN胚胎中大部分是由于孤雌生殖而形成,到目前为止,已有不少来源于1PN 或 0PN (2PB)胚胎来源的健康子代出生。

    进一步行 Logistic回归分析发现,1PN及0PN(2PB)胚胎的形成与女方的年龄、体重指数、基础内分泌(FSH、LH、E·、PRL、P、T)水平及获卵数无关,,而与患者选择的受精方式、 MII卵数以及形成的2PN数有关。出现这一结果的原因可能与进行Logistic回归分析时选择的自变量有限有关,本研究未对患者的不孕类型(原发不孕或是继发不孕)、超促排卵方案、HCG日的 FSH及 E2水平、Gn用量等进行分析,也未将这些因素纳入到研究中,可能会导致结果的偏差, 但 Logistic回归分析的结果有统计学意义,并不代表从专业知识角度也有意义,所以1PN及 0PN(2PB)胚胎形成的危险因素尚需进一步的研究。

    有研究认为1PN胚胎极有可能存在染色体异常,胚胎质量较差,发育潜能较低,多数胚胎存在发育停滞,只有约3o%发育至桑椹胚或囊胚,故认为其不具有临床价值，常作为废胚丢弃，仅在个别无正常受精的2PN胚胎的情况下考虑使用。本研究对IVF/ICSI周期受精后18-20h观察到的1PN及 0PN(2PB)胚胎进行体外培养至D6,并于 D5、D6 观察其囊胚形成情况,发现1PN 和 0PN(2PB)胚胎有相当比例可发育成嚢胚,但与2PN 胚胎相比,其卵裂率及囊胚形成率均明显降低,说明1PN 及 0PN(2PB)胚胎具有一定的发育潜能,但发育潜能较低, 与以往的研究结果相似。         综上所述, 1PN 和 0PN(2PB)胚胎具有一定的发育潜能,其形成可能受授精方式、 MII **数等因素的影响。本研究并未对这些“异常胚胎”进行染色体分析,也并未对患者移植这些胚胎, 因此,关于 IVF-ET中单原核来源的胚胎是否具有利用价值,尚需进一步的研究来证实。